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Oct 25, 2023

Mappatura degli oligonucleotidi tramite spettrometria di massa per consentire la caratterizzazione completa della struttura primaria di un vaccino a mRNA contro la SARS

Scientific Reports volume 13,

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 9038 (2023) Citare questo articolo

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La mappatura degli oligonucleotidi tramite cromatografia liquida con rilevamento UV accoppiato alla spettrometria di massa tandem (LC-UV-MS/MS) è stata recentemente sviluppata per supportare lo sviluppo di Comirnaty, il primo vaccino commerciale a mRNA al mondo che immunizza contro il virus SARS-CoV-2. Analogamente alla mappatura peptidica delle modalità proteiche terapeutiche, la mappatura oligonucleotidica qui descritta fornisce la caratterizzazione diretta della struttura primaria dell'mRNA, attraverso la digestione enzimatica, determinazioni di massa accurate e frammentazione ottimizzata indotta da collisioni. La preparazione del campione per la mappatura degli oligonucleotidi è una digestione rapida, con un unico contenitore e un solo enzima. Il digest viene analizzato tramite LC-MS/MS con un gradiente esteso e l'analisi dei dati risultanti utilizza un software semiautomatico. In un unico metodo, le letture della mappatura degli oligonucleotidi includono un cromatogramma UV altamente riproducibile e completamente annotato con una copertura di sequenza massima del 100% e una valutazione della microeterogeneità del limite del terminale 5' e della lunghezza della coda poli(A) terminale 3'. La mappatura degli oligonucleotidi è stata fondamentale per garantire la qualità, la sicurezza e l'efficacia dei vaccini a mRNA fornendo: conferma dell'identità del costrutto e della struttura primaria e valutazione della comparabilità del prodotto in seguito alle modifiche del processo di produzione. Più in generale, questa tecnica può essere utilizzata per interrogare direttamente la struttura primaria delle molecole di RNA in generale.

Due vaccini a RNA messaggero (mRNA), Comirnaty di Pfizer-BioNTech e Spikevax di Moderna, sono stati approvati dalla FDA, dall’EMA e da altre agenzie di regolamentazione in tutto il mondo per combattere la pandemia del coronavirus 2019 (COVID-19)1,2. Il COVID-19 è causato dall’infezione da sindrome respiratoria acuta grave da coronavirus-2 (SARS-CoV-2)3. I vaccini a mRNA possono essere utilizzati per l'immunizzazione, poiché contengono le istruzioni genetiche per l'autotraduzione della proteina immunogenica bersaglio4. L'mRNA nei vaccini COVID-19 approvati codifica per la proteina S-2P5, che differisce dalla proteina spike SARS-CoV-2 per due mutazioni stabilizzanti della prolina che generano una conformazione prefusione6. La sostanza farmaceutica mRNA (DS) è prodotta mediante trascrizione in vitro ( IVT) utilizzando la polimerasi T7 del batteriofago con N1-metil pseudouridina formando un RNA messaggero modificato con nucleoside (modRNA). modRNA DS viene successivamente incapsulato con nanoparticelle lipidiche (LNP) per il rilascio cellulare e la protezione dalle forze degradative. I modRNA-LNP formulati comprendono il prodotto farmaceutico (DP) che viene somministrato per la vaccinazione.

I produttori di farmaci hanno la responsabilità assoluta di caratterizzare e comprendere la struttura molecolare, la sequenza, l’eterogeneità e le impurità dei farmaci e dei vaccini finali che commercializzano. La struttura primaria generale dell'mRNA DS, dall'estremità 5' all'estremità 3', è: 5' Cap, 5' regione non tradotta (UTR), regione codificante l'antigene, 3' UTR e 3' coda di poliadenosina (poli(A) -tail)7 in un formato a filamento singolo. Per essere competente nella traduzione, l'mRNA deve essere chiuso all'estremità 5'8 e avere una coda poli(A) con un numero sufficiente di nucleotidi di adenosina consecutivi9. Il cappuccio 5' è spesso un guanosina trifosfato N7-metilato terminale 5' collegato al carbonio 5' del ribosio del successivo nucleotide di adenosina o guanosina, che può anche essere metossilato sul suo carbonio 2'10. Questi attributi del cappuccio 5' e della coda poli(A) conferiscono anche stabilità proteggendo l'mRNA dai processi di degradazione cellulare11,12. L'integrità della struttura primaria dell'mRNA a lunghezza intera, compreso il cappuccio 5' e i terminali della coda poli(A), rappresentano attributi di qualità critici per il DS del vaccino che sono attentamente monitorati per garantire la qualità del prodotto desiderata.

Negli ultimi decenni sono state sviluppate molteplici tecniche cromatografiche ed elettroforetiche di "mappatura degli oligonucleotidi"13,14,15. Più recentemente, sono stati sviluppati metodi di caratterizzazione dell'mRNA basati sulla spettrometria di massa (MS) che utilizzano la cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa con coppia ionica accoppiata alla spettrometria di massa (IP RP-HPLC-MS) per la caratterizzazione approfondita del 5′ Cap16 dei vaccini mRNA e 3′-Poli(A)-coda17. Tuttavia, questi richiedono purificazione e metodi analitici dedicati per la caratterizzazione di ciascun terminale. Recentemente sono stati sviluppati ulteriori metodi analitici che utilizzano digestione enzimatica e IP RP-HPLC con e senza MS tandem (MS/MS) per il sequenziamento oligonucleotidico di grandi RNA18,19,20,21,22. Vari enzimi in soluzione22 o RNasi T1 immobilizzata su particelle magnetiche sono stati valutati per una migliore copertura della sequenza. Nakayama et al. ha sviluppato un metodo di profilazione dell'mRNA basato su LC-MS utilizzando standard marcati con isotopi stabili. Nonostante il lavoro pionieristico sulla caratterizzazione della struttura primaria dell'RNA discusso in precedenza18,19,20,21,22, è vantaggioso per il settore disporre di un metodo analitico che sia completo e semplice da utilizzare. Una mappa oligonucleotidica ideale adatta per un'implementazione semplice è quella in grado di caratterizzare direttamente ed efficientemente l'intera lunghezza dell'RNA, compresa l'eterogeneità terminale 5' Cap e 3', in un digest one-pot e con un solo enzima, che non richiede alcuna marcatura con isotopi stabili. controlli. Risolve gli isomeri della sequenza e produce un cromatogramma UV completamente annotato con una mappa della massima copertura della sequenza.