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Aug 07, 2023

Espressione di reduttasi divergenti del metil/alchil coenzima M da archaea incolti

Communications Biology volume

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1113 (2022) Citare questo articolo

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I metanogeni e gli archaea anaerobici metano-ossidanti (ANME) sono attori importanti nel ciclo globale del carbonio. Il metil-coenzima M reduttasi (MCR) è un enzima chiave nel metabolismo del metano, catalizzando l'ultimo passaggio della metanogenesi e il primo passaggio dell'ossidazione anaerobica del metano. Geni mcr e simili a mcr divergenti sono stati recentemente identificati in lignaggi archeologici incolti. Tuttavia, l’assemblaggio e la biochimica degli MCR provenienti dagli archaea non coltivati ​​rimangono in gran parte sconosciuti. Qui presentiamo un approccio per studiare gli MCR da archaea incolti mediante espressione eterologa in un metanogeno, Methanococcus maripaludis. Il promotore, la struttura dell'operone e la temperatura erano determinanti importanti per la produzione di MCR. Sia il metanococco ricombinante che l'ANME-2 MCR si assemblavano con l'MCR ospite formando complessi ibridi, mentre l'ANME-1 MCR testato e l'etil-coenzima M reduttasi formavano solo complessi omogenei. Insieme alla modellazione strutturale, ciò suggerisce che gli MCR di ANME-2 e metanogeno sono strutturalmente simili e le loro direzioni di reazione sono probabilmente regolate dalla termodinamica piuttosto che da differenze strutturali intrinseche.

I metanogeni o archaea metanogenici sono considerati una delle prime forme di vita microbica sulla Terra1,2 e, insieme agli archaea anaerobici metano-ossidanti (ANME), svolgono un ruolo fondamentale nel ciclo globale del carbonio. Oggi i metanogeni producono circa un miliardo di tonnellate di metano ogni anno in ambienti anossici utilizzando vari substrati tra cui H2/CO2, formiato, acetato e composti C1-metilati3 oltre a quelli recentemente scoperti tra cui componenti del carbone4,5 e alcani a catena lunga6. Nei sedimenti marini anossici, si stima che circa il 90% del metano biogenico venga ossidato dall'ANME in CO2 utilizzando un percorso di metanogenesi inversa7, mitigando il rilascio di metano nell'atmosfera.

Tutti gli ANME e molti metanogeni rimangono incolti come colture monospecie. Basati su metagenomi ambientali e colture di arricchimento, gli ANME sono biochimicamente e geneticamente strettamente correlati ai metanogeni, condividendo un insieme simile di enzimi per l'ossidazione anaerobica del metano (AOM) nella direzione opposta alla formazione del metano8,9,10,11. Gli ANME utilizzano il metano come fonte di carbonio ed energia e trasferiscono gli elettroni dal metano ai partner batterici sintrofici che riducono i solfati9,12,13 o agli accettori di elettroni inorganici, come nitrato14, Fe(III)15,16,17 e Mn(IV)15 . Gli ANME conosciuti non costituiscono un unico gruppo tassonomico e appartengono agli ordini "Ca. Methanophagales" (ANME-1) e Methanosarcinales (ANME-2 e ANME-3)10. L'ordine Methanosarcinales contiene anche metanogeni. I dettagli fisiologici e biochimici dell'ANME rimangono in gran parte sconosciuti a causa della mancanza di colture pure e della lenta crescita degli arricchimenti8,18.

Il metil-coenzima M (CoM) reduttasi (MCR) è un enzima chiave del metabolismo anaerobico del metano19. Catalizza l'ultima reazione di formazione di CH4 nella metanogenesi e la prima reazione di attivazione di CH4 nell'AOM. La reversibilità della reazione MCR (reazione 1) è stata dimostrata sperimentalmente con un Methanothermobacter marburgensis MCR20. Recentemente è stato proposto il relativo alchil-coenzima M reduttasi (ACR) per catalizzare l'ossidazione degli alcani a catena corta (ad esempio etano, propano e butano) da parte degli archei anaerobici ossidanti gli alcani (ANKA)21,22,23,24.

Il complesso MCR è composto da un dimero di eterotrimeri (αβγ)2 con una molecola del coenzima tetrapirrolo F430 contenente Ni in ciascuno dei due siti attivi25. Ciascun F430 è profondamente sepolto all'interno del complesso proteico ed è accessibile solo dall'esterno tramite un canale di 50 Å formato da più subunità, McrA, A', B e G o McrA', A, B' e G'26,27. Lo stato di ossidazione del Ni(I) di F430 è necessario per l'attività. La coppia Ni(II)/Ni(I) ha un potenziale redox estremamente negativo (Eo') inferiore a ‒600 mV28, e pertanto MCR è molto sensibile all'ossigeno e richiede un sistema enzimatico complesso per l'attivazione riduttiva dipendente dall'ATP29. Molteplici modifiche post-traduzionali (PTM) uniche sono presenti nella subunità McrA e ottimizzano la stabilità e l'attività dell'MCR30,31,32. Sebbene le strutture cristalline di un ANME-1 MCR33 e di un'etil-coenzima M reduttasi (ECR)34 siano state risolte, l'assemblaggio e le proprietà biochimiche degli enzimi ANME e ANKA rimangono poco compresi. L'espressione eterologa dei geni che codificano per un MCR ANME-1 in Methanosarcina acetivorans ha stimolato l'ossidazione del metano da parte dell'organismo ricombinante, fornendo ulteriori prove del ruolo di questi enzimi35. Recentemente, il MCR di Methanothermococcus okinawensis è stato espresso eterologamente nel modello metanogeno Methanococcus maripaludis36. Qui, abbiamo sviluppato ulteriormente l'espressione eterologa degli MCR in M. maripaludis che apre la strada allo studio dei complessi enzimatici degli archei non coltivati.